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G418原理及筛选方法
酷尔化学 / 2018-03-21

G418

原理及筛选方法

原理

 

        

分析转化的功能和表达需要

DNA

稳定转染至宿主细胞染色体。外源基因进入细胞后,

部分能够通过细胞质进入细胞核内,根据细胞类型,至多

80%

的进入核内的外源

DNA

得到

瞬时表达。极少数情况下,进入细胞的外源

DNA

通过系列非同源性分子间重组核连接,最

终整合进细胞染色体。

细胞基因组自由部分表达,

所以整合并不一定意味着表达,

只有整合

到表达区的基因才会表达,而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同

的。由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件,通常根据新表型筛选稳定转染体。一般

情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。

细菌

Tn5 

转座子序列

neo

抗性基

因)携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将

G418

转变成无毒形式。

  

        G418 

是一种氨基糖类抗生素,其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似,它通过影

80S

核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性,包括细菌、酵母、

植物和哺乳动物细胞,

也包括原生动物和蠕虫。

是稳定转染最常用的选择试剂。

neo

基因

被整合进真核细胞基因组合适的地方后,则能启动

neo

基因编码的序列转录为

mRNA

,从

而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达,

使细胞获得抗性而能在含有

G418

的选择

性培养基中生长。

G418

的这一选择特性,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因

动物等方面得以广泛应用。

   

        

在进行转染时细胞膜受到影响,抗生素可能对细胞产生较大影响,加上

G418

有杀菌作

用,所以有人主张转染时不加其它抗生素。其实

G418

本身有很好的杀菌效果,在用

G418

进行筛选的过程中很少会发生污染。

但有一点,其实我觉得问题也不是很大,那就是:

在老

外的一本实验手册中提到,

在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。

我想他的想

法可能是脂质体对细胞膜有影响,

可能此时加抗生素对细胞损伤较大。

因为庆大霉素、

链霉

素、

G418

均是氨基糖甙类药物,其药理作用完全一样。所以没有必要再用,而且由于另外

抗生素的添加实际增加氨基糖甙类药物的浓度,剂量有误差,不利于各实验室之间的交流,

在实际操作中,培养液中有抗生素对细胞培养与筛选影响不大。

 

有人认为用磷酸钙共沉淀转染法筛选稳定整合子较好,

但这种观点是很多年以前的观点

了,而且只是少数人的观点。我两种方法都用过,但没有特异的比较过,感觉都可以。磷酸

钙便宜,但对溶液配置和实验操作要求很高,尤其是溶液的

pH

值,要求精确到小数点后

2

位。

脂质体是现在主流的转染试剂,

从没有人说这种方法做整合稳定表达不行。

非脂质体是

这几年发展很快的技术,转染效率低,细胞毒性小,价格也不贵,

Qiagen

就有一个系列。

我个人觉得不必要花太多时间在这方面,

自己实验室用得好的技术可以坚持,

没有经验的可

以选择一个较著名的公司的产品开始,

购买之前先下载个说明书看看。

有精力就比较一下几

种方法,一般的达到目的就行了。关键是实验设计。

  

                                                          ----------

主要参考《细胞培养和分子细胞学技术》和《分子

克隆》

  

G418

筛选实验设计

   

筛选之前

 

        

由于每种细胞对

G418 

的敏感性不同,

一般变动在

100ug/ml~1000ug/ml

范围。

而且不同

的厂家生产的相同浓度的

G418

的活性不尽相同,所以在筛选之前,一定要确定你的细胞对

这一批

G418

的最佳筛选浓度。

尽管如此,

特性明确的细胞系

G418 

的最佳用量还是稳定的。

《分子克隆》给出了几个常用细胞系所需

G418 

的最佳用量。

         

 

细胞系或机体

  G418

浓度(

ug/ml

    

中国仓鼠卵巢细胞

  700~800    

Madin-Darby

犬肾细胞

  500 

G418

原理及筛选方法

 

原理

 

        

分析转化的功能和表达需要

DNA

稳定转染至宿主细胞染色体。外源基因进入细胞后,

部分能够通过细胞质进入细胞核内,根据细胞类型,至多

80%

的进入核内的外源

DNA

得到

瞬时表达。极少数情况下,进入细胞的外源

DNA

通过系列非同源性分子间重组核连接,最

终整合进细胞染色体。

细胞基因组自由部分表达,

所以整合并不一定意味着表达,